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熒光檢測藻藍蛋白—譯文及原文3

瀏覽次數             發布日期:2008-07-21 14:18:03            作者:jy17

譯文及原文
熒光檢測藻藍蛋白
作為水庫進水口藍藻在線早期預警系統

Katarzyna Izydorczyk,1 Malgorzata Tarczynska,2 Tomasz Jurczak,2 Jaroslaw Mrowczynski,2 Maciej Zalewski1
1國際生態中心,波蘭科學院,3泰納街,90-348羅茲,波蘭
2應用生態學院,羅茲大學,巴納察12/16,90-237羅茲,波蘭

2005年1月26日收到;2005年3月28日修訂;2005年3月30日接收

摘要

飲用水水庫中的藍藻赤潮,可能會導致不同的水質問題,包括它們的味道和氣味,并且注定會危害飲用水供給。作為對這個問題的回應,一個在進水口分析藍藻濃度的在線監測工具是有一定的實用價值的。本研究在低地的飲用水水庫,利用在線檢測顯示銅綠微囊藻爆發期間,藻藍蛋白的熒光強度和藍藻生物量呈正相關性。最高的相關系數位于藍藻生物量濃度低15毫克鮮重/升,這表明這種方法可以作為一種有效的預警系統。風漂移使更高的藍藻濃度進入進水口時,熒光強度急劇變化,這表明熒光可被應用于動態植物活動的快速預警。?2005年出版社,期刊,公司,環境毒物20:425-430,2005。

關鍵詞:微囊藻;藻藍蛋白;熒光;微囊藻毒素;飲用水水質

 

緒論

飲用水水庫的藍藻赤潮是當前水處理工藝的重大挑戰,如果有毒素存在,則構成了消費者健康的潛在危險(Falconer,1994年,2005年;Codd,2000年;Mankiewicz等人,2003年)。微囊藻及其他藍藻屬所產生的微囊藻毒素,是可能的致癌物質,有腫瘤促進作用,并會導致原發性肝癌(Carmichael,1992年;Fujiki等人,1996年)。Falconer等人(1988年),Carmichael和Falconer(1993年),Codd等人(1997年)已經報道過因攝食水或含毒素的細胞而中毒和死亡的家畜和野生動物。世界衛生組織(WHO)建議的飲水中最高濃度微囊藻毒素是1微克/升(Chorus和Bartram,1999年),波蘭自2002年以來也已經通過了這項立法(衛生管理部門,2002年)。
因為傳統的飲用水處理過程中沒有充分有效的去除味道,氣味和毒素,人類會曝露在這些有害物質中。因此,重要的是在原水中要有一個有效率的藍藻預警系統,可以提供快速的信息用于水處理。
Bartram等人(1999年)為藍藻提出了一項警戒級別的框架,為水處理廠的運作和管理提供了監測和管理的順序。它是基于藍藻細胞計數和葉綠素a濃度的。不幸的是,這些方法不適合在線監測。在測量藍藻特征色素的光子發射量的基礎上,熒光測量藻藍蛋白是一個非常靈敏的方法(Rohacek和Bartak,1999年;Maxwell和Johnson,2000年)。它不需要預處理水樣本,可以提供快速的結果。
一個公認的最好的熒光測量應用實例是研究葉綠素a濃度(Pinto等人,2001年)。不過,葉綠素a含量的測量,并不區分真核浮游植物和藍藻,這對于在混合浮游植物組合中選擇性的檢測藍藻尤為重要;旌细∮沃参锝M合中藻藍蛋白含量是表示水樣中藍藻含量的一個非常有用的指標(Watras和Baker,1988年;Otsuki等人,1994年;Lee等人,1995年;Hashimoto和Otsuki,1995年;Hashimoto等人,1997年;Ahn等人,2002年;Vincent等人,2004年)。
本文報導運用藻藍蛋白熒光技術在飲用水進水口在線檢測藍藻。分析了在低地水庫微囊藻華爆發期間,藻藍蛋白熒光強度,藍藻生物量和微囊藻毒素濃度之間的關系。
 

材料和方法

在皮里卡河流域的素勒舟水庫,是該地區的城市和一個游樂區的主要飲用水源。水庫富營養化,平均總磷濃度約0.38毫克/升(Wagner和Zalewski,2000年)。葉綠素濃度在生長季節,平均值達到30毫克/立方米,在浮游植物爆發期間可以超過100毫克/立方米。藍藻中優勢種是銅綠微囊藻。分析藍藻藻華樣本證實,它們具有極強的肝毒特性(Tarczynska等人,2001年;Jurczak等人,2004年)。
在水庫中央部分一個狹窄的分隔區的盡頭,是素勒舟–羅茲飲用水供水區的進水口,應用熒光在線檢測作為一個早期預警系統調查這里。
熒光測量原水中的藻藍蛋白,采用了10-AU-005型特納熒光儀和藻藍蛋白光學套件(P/N:10-305),其中包括一個冷白色汞蒸氣燈,一個630納米激發過濾器,一個660納米發射過濾器。該熒光設置為連續流動模式。水流通過一個25毫米區域。最低檢測水平約為1000細胞/毫升。測量從2002年8月至2002年9月和從2003年5月至2003年9月,期間用一臺數據記錄儀每隔15分鐘收集一次數據。
在同一時期,每周收集兩次水質樣本進行物理,化學和生物分析。在實驗室里水樣中浮游植物的估計被保存在盧卡斯試劑并沉積。浮游植物計數使用Fusch-Rosenthal計數細胞。在運用幾何近似進行細胞體積分析的基礎上,確定浮游植物的生物量(鮮重)。生物量的計量從以體積單位換算成以鮮重(FM)為單位,假設體積的一個單位(=1)是某一浮游植物鮮重的一個單位(Komarkowa等人,1995年)。
微囊藻毒素的分析有兩種形式:溶解于水中和束縛于懸浮物中。用懸浮物分析,水樣通過一個Whatmann GF/C 0.45微米的過濾器過濾,立即凍結在-20℃。微囊藻毒素從懸浮物質中提取在75%甲醇水溶液中。樣品在Misonix(Farmingdale,NY,美國)超聲波儀、超聲波探頭(100瓦特,直徑19毫米,有一“尖頭”)和液體處理器XL中超聲波震蕩30秒。提取物在Eppendorf 5804離心機(德國)中4℃的溫度下以11000克離心10分鐘,離心兩次。收集上清液在SC110A Speedvac Plus(Thermo Savant,Holbrook,NY,美國)中蒸發。在高效液相色譜分析樣品之前,樣品析出在一毫升75%的甲醇水溶液中,過濾通過裝有0.45微米的GHP膜和尖頭插座(德國)的Gelman GHP Acrodisc 13毫米口徑的注射過濾器。溶解微囊藻毒素的1升過濾水樣集中于Baker(荷蘭)的固相萃。⊿PE)系統,用90%甲醇水溶液與0.1%三氟乙酸(黃蜀葵總黃酮)從C18色譜柱洗脫。甲醇被蒸發,樣品析出在一毫升75%的甲醇水溶液中,準備高效液相色譜分析。
測定微囊藻毒素的高效液相色譜-二極管陣列法,采用水-三氟乙酸-乙腈梯度做流動相,C18做固定相,在200-300納米二極管陣列檢測。樣品分析使用了一個高性能的液相色譜儀配備梯度泵,自動進樣器,柱式加熱爐,和Agilent科技(Waldbronn,德國)的光電二極管陣列(PDA)探測器(Agilent 1100系列)。固定相是Purospher STAR RP-18柱LiChroCART(55×4毫米標識;3微米)。該柱由一名警衛柱保護。流動相由線性梯度溶劑A(水與0.05%三氟乙酸)和溶劑B(乙腈與0.05%三氟乙酸)組成:25%B用0分鐘,70%B用5分鐘,70%B用6分鐘,25%B用6.1分鐘。注射量20微升,流速1毫升/分鐘,柱溫40℃。在藍藻提取物中的微囊藻毒素,通過它們的特征吸收光譜和保留時間,對照微囊藻毒素的標準,確定了是MC-LR,MC-RR,和MC-YR。
 

結論

2002年夏季,素勒舟水庫浮游植物群落以藍藻為主(98%),主要是銅綠微囊藻,也有雙鞭藻,惠氏微囊藻,水華束絲藻和假魚腥藻。觀察藍藻最高生物量,在8月中旬,達至50毫克/升(圖1)。2003年期間浮游植物生物量較低。在春季浮游植物群落以硅藻為主,如扭曲小環藻,微星鼓藻,鈍脆桿藻,矽藻和美麗星桿藻,硅藻的最大生物量為15毫克/升。在夏季以藍藻(銅綠微囊藻)為主,最大生物量的峰值為10毫克/升。種類繁多的隱藻(馬索隱藻,卵形隱藻,Platyuris隱藻)和綠藻(衣藻,柵藻,S. bicaudatum綠藻,短棘盤星藻)是微不足道。

 

2002年暑假藻華爆發期間,兩次觀察到最高濃度的微囊藻毒素超過7微克/升(圖2)。八月微囊藻毒素溶解于水中的濃度高于在細胞中的濃度。這個比例在9月發生變化。2003年,微囊藻毒素的濃度低,在0.0和0.5微克/升之間波動,其中只有兩個濃度高于1微克/升。

 

以100為相對單位(原始)的最高強度藻藍蛋白熒光值,是2002年夏季藍藻爆發的時候(圖1和2)。熒光強度八月底下降了,原始值在1.5和11.6之間振蕩。2003年,藻藍蛋白的熒光強度原始值在0.2和13.4之間振蕩。
應用連續流動模型的熒光檢測方法,每天觀察原水中藻藍蛋白熒光強度的變化(圖3)。熒光原始值2小時內從18增至75是強風擾動進水口附近的藍藻聚集的結果。前一天穩定的天氣狀況致使一直保持著平穩而較低的熒光強度。

 

研究表明,藍藻生物量低于15毫克/升時,藻藍蛋白的熒光強度和藍藻的生物量呈正相關關系(r=0.65,n=32,p<0.05)[圖4(A)],浮游植物以具有肝毒性的銅綠微囊藻為主。生物量超過15毫克/升的熒光值不包括在相關性分析內,因為該藻華爆發的天數在統計上微不足道。
研究還表明,微囊藻毒素總濃度低于3微克/升時,藻藍蛋白熒光強度和微囊藻毒素總濃度的呈中等程度的相關性關系(r=0.51,n=31,p<0.05)[圖4(B)]。當藍藻生物量和藻藍蛋白的熒光分別在其最高峰時(2002年8月13日),觀察到了最高濃度的微囊藻毒素(約7 g微克/升)。然而在9月9日,當熒光和生物量水平低的時候,也觀察到了高濃度的微囊藻毒素。微囊藻毒素總濃度高于3毫克/升的熒光值不包括在相關性分析內,因為它們的數量在統計上微不足道。藍藻生物量和微囊藻毒素總濃度之間的相關系數比藻藍蛋白熒光和微囊藻毒素之間的相關系數高[r=0.74,n=31,p<0.05;圖4(C)]。
 

討論

在飲用水處理中,一個早期預警系統能提供及時的原水水質信息,為水廠運作提供建議。在建立一個早期預警系統的第一步是選擇檢測器(Grayman等人,2001年)。要檢測藍藻,有效的選擇性檢測在混合浮游植物群落中的藍藻是特別重要的。藻藍蛋白是藍藻的特性,熒光測量藻藍蛋白是表示原水中藍藻濃度的一個高度敏感的指標。在藍藻生物量約為0.2毫克/升,相當于1113個細胞/毫升時,能夠獲得積極的熒光信號。按照WHO警戒級別框架,這檢出限對應的閾值定義為警戒級別1(Bartram等人,1999年)。同時,當浮游植物群落以硅藻和綠藻為主時,即使總浮游植物生物量很高,藻藍蛋白的熒光也是微乎其微的(圖1)。這些結果表明,藍藻監測從水華發展非常早期的階段開始,并且可以清楚地分離浮游植物的其他組成部分所給予的信號。
Lee等人(1994年)發現,濃度在104-106細胞/毫升的范圍內,藍藻細胞數和藻藍蛋白熒光呈線性關系。Ahn等人(2002年)發現,藍藻細胞數量與藻藍蛋白濃度的相關性比藍藻細胞數量與葉綠素濃度的相關性要高。同樣,該研究表明,藻藍蛋白熒光和藍藻生物量呈正相關關系。在相關性[圖4(A) ]中,分散的點是由于每個藍藻細胞中藻藍蛋白濃度不同的差異而造成的。這可能是氮源或光線影響每個藍藻細胞中藻藍蛋白含量的結果。因為藻膽蛋白是氮儲備,所以這就是為什么氮限制誘導藻藍蛋白降解的原因(Rapala,1998年)。低光照強度可能會刺激合成藻藍蛋白(Grossmanet等人,1994年)。
這項研究其他方面的調查是應用藻藍蛋白熒光估計微囊藻毒素濃度。研究表明,藻藍蛋白熒光強度和微囊藻毒素總濃度之間具有中等程度的相關性,低于藍藻生物量和微囊藻毒素總濃度之間的相關性。許多作者表明,每個藍藻細胞中的微囊藻毒素濃度不是常數,取決于溫度和可用性營養鹽等參數(Codd和Poon,1988年; Orr和Jones,1998年; Rapala,1998年; Long等人,2001年)。2002年8月13日記錄的高密度微囊藻藻華爆發,觀察到大量的細胞分解,導致水中出現非常高的可溶性微囊藻毒素濃度(圖2)。在這種情況下,藻藍蛋白被釋放到水迅速降解。此外,該低相關性可能是由水庫入水口有毒和無毒的藍藻共存造成的。測量藻藍蛋白熒光,可被視為一個水中藍藻細胞濃度的指標,類似于既定的每毫升水中藍藻細胞數目的指標。葉綠素a測量和總浮游植物生物量測量沒有多少信息價值,因為這些措施包括了真核浮游植物。不過,熒光方法是不足之處是無法直接估計毒素的濃度。按照WHO警戒級別框架,表明藍藻細胞豐度的同時,涉及到的第二個決定就是要求毒性的評估或毒素的檢測。
隨著檢測頻率的增加,早期預警系統的效率需要提高(Grayman等人,2001年)。較長時間的采樣測樣會拖延檢測,并削減水處理廠作出正確行動的時間,也可能會導致遺漏了一些短暫事件。藍藻赤潮的特點是高度動態的變化,在長時間內因季節性因素,或者在短時間內(幾個小時)因為天氣因素而變化。因此,優化水處理工藝應根據連續監測原水中的藍藻細胞。測量藻藍蛋白的熒光,提供快速的結果,而不必花費時間進行人工水樣預處理。應用熒光流動模式證實了連續監測(每15分鐘)藻藍蛋白熒光強度的重要性(圖3)。
藻藍蛋白的熒光測量,也可用于檢測作為飲用水水源的水庫的水質。藻藍蛋白的熒光測量,可以檢測水庫中藍藻細胞的縱向和橫向分布,優化深度飲用水的提取。水平分布的檢測,可用于預測水庫中藍藻水華的產生和易位的潛在危險。

 

 

 

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